衣藻β–胡萝卜素加酮酶基因在南瓜果实中的瞬时表达

为了研究β–胡萝卜素加酮酶基因在南瓜中合成酮基类胡萝卜素的功能,采用农杆菌介导瞬时表达技术,将含有衣藻β–胡萝卜素加酮酶基因CrBKT的pBI121-CMTPCRBKT载体和pBI121对照载体的农杆菌菌液注入授粉后2、5、10、15和25 d的南瓜果实中,3 d后观察发现,授粉后2和5 d的果实转化后果肉呈微红,其中授粉后5 d的颜色较深,而10 d以上的无红色色素积累。经高效液相色谱(HPLC)分析色素成分,发现积累的红色色素为酮基类胡萝卜素角黄素和虾青素。与对照相比,注入CrBKT基因的授粉后2和5 d的幼果中的类胡萝卜素含量显著增加,5 d的幼果约增加了1/3,且含有106.31μg·g~(-1)酮类胡萝卜素,其中角黄素占80.65%,虾青素占19.35%,而授粉后10 d以上的果实类胡萝卜素含量没有明显变化,也没有酮类胡萝卜素的积累。PCR扩增表明转化组织中表达了该基因。结果表明,CrBKT基因只能在授粉后5 d以内的幼果中表达,并将幼果中的类胡萝卜素转化为酮基类胡萝卜素;随着果实成熟,菌液在果肉组织中无法渗透而阻碍基因表达。     

莱茵衣藻氮胁迫基因数字表达谱分析

以正常培养条件下的莱茵衣藻为对照，通过数字表达谱技术对缺氮诱导3 d的藻细胞进行转录水平上的检测，并结合pathway分析。结果表明：差异表达基因共有482个，其中上调表达基因108个，下调表达基因374个；这些差异表达的基因共分布在85个pathways中。此结果为进一步揭示氮元素缺乏诱导微藻油脂积累的分子机理提供有用信息。     

pH值和氮素对莱氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)胞外碳酸酐酶活性的影响

对莱氏衣藻在不同ｐＨ值下胞外碳酸酐酶活性变化的观测表明,在ｐＨ７．２时诱导的酶活性最高,而ｐＨ５．５时诱导的酶活性明显低于ｐＨ７．２和ｐＨ９．０时诱导的酶活性。氮素对胞外碳酸酐酶基因表达也具有重要调控作用,在从高ＣＯ２浓度转入低ＣＯ２浓度时,缺氮或低氮浓度抑制胞外碳酸酐酶活性的增加,铵态氮诱导的酶活性高于硝态氮。     

肿瘤坏死因子α单链抗体基因的优化及衣藻叶绿体表达载体的构建

通过在EMBL数据库中搜索鼠源TNF-α单链抗体基因同源性最高的人胚系抗体基因TNF-α-ScFv,进行人源化改造,并选择衣藻叶绿体偏爱的密码子对TNF-α-ScFv基因进行优化,随后构建带psbA启动子:TNF-α-ScFv::psbA 3′终止子表达框的中间载体,再将psbA启动子:TNF-α-ScFv::psbA 3′终止子表达框插入衣藻叶绿体表达载体p322中,通过PCR和酶切鉴定,确定已成功构建了TNF-α-ScFv基因的衣藻叶绿体表达载体。     

莱茵衣藻增殖沉降与死亡过程对太湖底泥氮素释放的影响

以太湖梅梁湾为研究原型区域,采集水样和泥样,通过室内模拟实验,添加莱茵衣藻（ChlamydomonasReinhardtii）于水-泥体系中,研究了莱茵衣藻增殖、沉降与死亡过程对底泥氮素释放的影响。结果表明,莱茵衣藻在大量增殖过程中伴随着藻体沉降,沉降过程中大部分藻体死亡,小部分藻体聚集在底泥表面,当养分增加时其再次增殖并悬浮;藻体增殖、沉降与死亡过程促进了底泥NH4＋-N的释放;上覆水NH4＋-N累积消耗量与底泥脲酶活性呈显著正相关关系。     

胞外聚合物对莱茵衣藻砷富集和形态转化的影响

为探明胞外聚合物(EPS)对微藻砷的富集和迁移的作用效果,采用1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)对莱茵衣藻EPS进行提取,测定EPS含量及其主要成分,运用LIVE/DEAD BacLight staining–LSCM观察去除和未去除EPS的莱茵衣藻的生长情况,并对藻细胞进行AsV处理(20μg/L、处理6.0 h),比较有(无)EPS的莱茵衣藻对砷的吸收、吸附和转化的差异。结果表明:莱茵衣藻EPS总量为16.12 mg/g,其主要成分为多糖(89.96%),并含有少量的蛋白质(7.41%)和DNA(2.63%),EDTA提取EPS后没有细胞自溶现象产生,不影响微藻的生长;去除EPS后的莱茵衣藻对AsV的还原能力显著降低,且在6.0h内对砷的吸收没有明显变化,但砷吸附量占富集的比例(43.03%～66.23%)显著高于有EPS的砷吸附占比(10.68%～31.90%),表明EPS在莱茵衣藻对砷的富集和形态转化中具有重要作用。     

pH与氟对莱茵衣藻和蛋白核小球藻胞外碳酸酐酶活性及光合效率的影响

本文研究了不同pH(5.0、7.0和9.0)和F-浓度(0.1、1、10、50、100、200mmol·L-1)对莱茵衣藻和蛋白核小球藻的胞外碳酸酐酶活性、PSⅡ实际光合效率ΦPSⅡ和叶绿素a合成量的共同影响。结果表明:在低于1mmol·L-1的F-作用下,两种微藻的生理和生长指标主要受pH影响;酸性条件下,两种微藻胞外碳酸酐酶活性显著低于中性和碱性条件时,ΦPSⅡ随pH升高而增大,叶绿素a合成量随pH升高而增加。在高于1mmol·L-1的F-作用下,两种微藻的生理及生长指标受F-和pH共同影响,且F-的作用大于pH的作用,胞外碳酸酐酶活性随着F-浓度升高先增加后降低,同时随着pH下降而降低;ΦPSⅡ和叶绿素a合成量则随着F-浓度升高和pH下降而迅速下降。胞外碳酸酐酶活性、ΦPSⅡ和叶绿素a合成量都能够作为指示微藻受氟胁迫的指标,以微藻为材料除去自然界氟超标水体中的超标F-,理论上是可行的。     

Cd胁迫对受驯莱茵衣藻影响的非损伤微测初步研究

利用扫描离子选择性电极技术对Cd胁迫驯化莱茵衣藻进行研究,发现CC-124型莱茵衣藻在10、100μg/L Cd胁迫长期驯化培养后细胞表面的Cd2+流速由于前期受到胁迫而有所下降,CC-400型衣藻经胁迫驯化培养后并未有明显变化,其前期表面吸附对其表面吸附流速的影响较小。CC-124型与CC-400型莱茵衣藻表面的Ca2+、H+流都不明显,长期Cd胁迫驯化培养衣藻也未见有明显流速,加入高浓度Cd后也未有明显流速产生,细胞表面Cd2+与Ca2+、H+的置换反应并不强烈。根据所得流速数据建立吸附模型,与其他模型相比具有对吸附过程实时监测、不对细胞造成损伤等特点。     

莱茵衣藻type I metacaspase基因克隆及其参与调控程序性细胞死亡研究

Metacaspase是在原生动物、真菌和植物中发现的一种具有底物精氨酸/赖氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶。根据蛋白质结构特征可将metcaspase分为typeⅠ与typeⅡ两种类型,均参与调控多种植物与原生动物程序性细胞死亡。本研究根据GenBank数据库莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) type I metacaspase基因(GenBank No. XM_001696904)序列,采用巢式PCR克隆获取type I metcaspase基因开放阅读框(ORF)序列并命名为CrMC1。CrMC1 ORF全长987 bp,推测编码1个包含405个氨基酸的蛋白质。通过与已知物种type I metacaspase氨基酸序列进行同源序列比对发现,CrMC1具有高度保守的p20、p10、连接区结构域以及精氨酸、半胱氨酸活性中心位点。研究显示,在H2O2诱导的莱茵衣藻程序性细胞死亡过程中,CrMC1表达量显著提高(P<0.05),2 h后达到峰值,3 h时下降至对照组同一水平。结果表明,莱茵衣藻type I metacaspase基因CrMC1参与H2O2诱导的莱茵衣藻程序性细胞死亡调控。     

以莱茵衣藻为载体表达外源抗菌肽的研究

将黑水虻抗菌肽基因sarcotoxin3转入到莱茵衣藻细胞中,以期实现抗菌肽活性片段的大规模表达生产,为将来完成抗菌肽的临床测试及水产应用奠定实验基础。以质粒pHK85为骨架,插入荧光素酶基因和黑水虻抗菌肽sarcotoxin3基因,用DNA连接酶将质粒连接,构成抗菌肽质粒。抗菌肽质粒经克隆、提取、酶切线性化、衣藻玻璃珠转化、荧光素酶活性筛选和抑菌实验,结果表明:经过测序进一步确认质粒成功构建,碱基序列与所设计质粒序列一致,质粒浓度472.8 ng/μL、纯度(A_(260)/A_(280))1.93,7 d后每个巴龙霉素平板长有单克隆约200个,大多数单克隆荧光素酶活力值可高达10~6,少数单克隆荧光值甚至可达10~8;藻株在26 kDa附近出现了特异信号,含有抗菌肽的蛋白对大肠杆菌DH5α有一定的抑制作用。莱茵衣藻可以作为抗菌肽外源表达的一种载体,为抗菌肽的大量生产提供了一种可能。